发布日期：2024-11-01 14:30 点击次数：55
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KAPA文库定量试剂盒
传统DNA文库定量的圭臬历程消耗东谈主力、时分，资本高，而单独采取常限定量的规律测量的是总的核算浓度，且聪颖度低、信得过度差。最好的簇密度或模板与磁珠的比率取决于顺应的能进行PCR扩增的DNA分子的浓度，KAPA文库定量试剂盒考究通过高性能qPCR的规律对文库进行定量，减少簇密度或模板与磁珠比例的相反，同期减少传统圭臬历程的时分消耗、排斥奋斗的滴定操作。
1、居品愚弄
能准详情量大于0.0002pM包含完好引物序列的文库
能准详情量GC含量跨度大的文库
能准详情量平均片断长度为1kb的文库
2、KAPA文库定量试剂盒历程
试剂盒包含：KAPA SYBR FAST qPCR、6个线性DNA圭臬品（10倍浓度稀释）、10×Primer Premix
1.将1ml的Primer Premix加入到5ml的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2x)中；
2.稀释dsDNA文库
用10mM Tris-HCI对文库进行1:1000倍稀释，如若需要可进行：1:2000，1:4000，1:8000稀释；
3.准备qPCR反映
20μl反映体系：12μl的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（含Primer Premix）、4μl PCR水、4μl稀释的文库DNA或DNA圭臬品；
4.qPCR反映
肇端变性5分钟，然后35个轮回（95℃30秒、退火/延迟60℃45秒）；
5.数据分析
阐发扩增成果位于90-110%之间；
6.缱绻文库浓度
把柄评释书提供的公式推算皆备文库浓度；
7.把柄缱绻所得的文库浓度推算未稀释的文库浓度，然后进行下一步本质。
3、居品上风
（1）qPCR文库定量简化责任历程
KAPA文库定量试剂盒排斥了消耗时分且奋斗的滴定操作，提供了简化高通量历程的精良模样。
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（2）可靠的文库定量大约使簇密度均一性好
（3）qPCR能灵验扩加多样类型模板
传统qPCR试剂适用于短片断扩增，而对长片断、GC含量不平衡、复杂结构的片断扩增成果低，某些文库分子的定量不行靠。为了定量复杂DNA文库，KAPA额外矫正了一种基于SYBR Green qPCR的酶，能灵验扩增对野生型酶来说扩增穷苦的模板。KAPA文库定量试剂盒包含了该基因工程矫正酶以确保能灵验扩增长片断及GC含量跨度大的文库，对文库定量准确。
上图：qPCR扩增前后片断大小散布 扩增前（灰色区）和用3种生意化的qPCR mixes （KAPA SYBR Fast(蓝)，竞争试剂S（红），竞争试剂F（橙））扩增后的片断大小散布。对比试剂包含野生型Taq酶。反映按如下轮回法子：95℃ 10min，40个轮回95℃ 10sec 60℃ 45sec。
上图：踏实的扩增使不同文库qPCR定量准确KAPA文库定量试剂盒用于定量两个Illumina GA文库的浓度，这两个文库GC含量额外（Rhodococcus sp.～70%GC，如图，Staphylococcus sp.～35%GC未展示）。两个文库扩增成果均大于95%。样本纠合两倍稀释（1:1000到1:16000），每个梯度3个近似，PCR反映参照居品使用评释书推选参数。
可靠的DNA定量圭臬品，批次之间相反最小
上图：KAPA文库文库定量试剂盒的批次间相反（Roche Titanium系列平台） 通过分析3个不同批次（红、粉、蓝）居品的圭臬品的扩增图谱进行比拟。每个点成就3个近似，并缱绻平均值。
上图：批次间及试剂盒间的相反最小 使用不同批次和并吞批次不同KAPA文库定量试剂盒（Illumina GA平台）对9个东谈主源DNA文库和两个micro DNA文库进行定量并比拟定量完了。
